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肾病患儿免疫细胞对肾小球上皮细胞合成基质的影响

2007-06-12    若您想了解自身病情,日常饮食方案,咨询本身肾病治疗是否规范? 可拨打7×24小时肾病咨询电话:0311-85866350    或点击下面“向专家咨询”按钮,即时向专家咨询!
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  [石家庄肾病小儿肾病科摘录]iJu儿童肾病网

  目的 为了明确免疫细胞对肾小球上皮细胞(glomerular epithelial cell GEC)合成功能的直接作用。方法 应用肾小球细胞体外培养,同位素掺入及放射免疫技术,以总胶原,层粘连蛋白,Ⅲ型前胶原及Ⅳ型胶原的合成为观察指标,动态研究了不同病理类型原发性肾病综合征(INS)患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)对GEC生物功能的影响。结果 (1)肾病极期未经激素治疗组(未治组)PBMC上清明显促进了GEC合成层粘连蛋白;(2)未治PBMC上清抑制了GEC合成总胶原;(3)未治组PBMC上清促进了Ⅲ型前胶原的合成,而对Ⅳ型胶原的合成无明显影响;(4)肾病患儿PBMC的上述作用与是否足量激素治疗有关,而与尿蛋白能否阴转、肾组织病理类型、肾病临床类型等无直线相关关系。结论 原发性肾病患儿循环免疫细胞可影响GEC合成细胞外基质的功能。免疫细胞的这种活性可被激素治疗改变。iJu儿童肾病网

  近十年的研究显示肾病患者(儿)免疫细胞培养上清可致大鼠的蛋白尿,并诱使大鼠肾小球发生类似人类微小病变型肾病的形态改变[1,2]。更有研究发现,用吸附法去除肾病患者的循环免疫物质,可大大减少患者的尿蛋白,而被吸附物物质注入动物则可致蛋白尿[9]。上述临床和实验室的观察验证了免疫细胞产物对肾小球细胞功能的影响,但其机制尚不明了。iJu儿童肾病网

  EGC合成的细胞外基质参与了肾小球基底膜特有的“中间致密、内外稀疏”的网状结构的组成,赋于基底膜选择性通透功能,并且参与了肾小球细胞与基底膜的固着[3,7],稳定了肾小球的结构。GEC合成功能的改变将导致肾小球通透功能受损而出现蛋白尿。为了从细胞水平认识免疫细胞与肾小球细胞的相互作用,明确免疫细胞产物对GEC合成功能的直接影响,我们观察了原发性肾病患儿外周血单个核细胞(PBMC)产物对体外培养的大鼠GEC合成层粘连蛋白(LN)、总胶原及胶原种类的作用。iJu儿童肾病网

  材料与方法iJu儿童肾病网

  一、材料 3 H-prolin(羟脯氨酸)为原子能研究所产品;LN及Ⅳ型胶原放射免疫分析检测盒为上海海军医学研究所生物技术中心产品;Ⅲ型前胶原放射免疫分析盒为重庆市肿瘤研究所中心研究室产品;SD大鼠为本院实验动物中心养殖。iJu儿童肾病网

  二、方法iJu儿童肾病网

  1.病人及分组:INS患儿28例,临床表现为单纯型的20例,肾炎型8例;23/28名接受了肾活检,病理诊断为系膜增殖型肾小球肾炎者12例,轻微病损者9例,微小病变型肾病者1例,膜性肾病(Ⅰ型)者1例。所有诊断符合1979年全国儿科肾脏病协作组制定的诊断标准。iJu儿童肾病网

  分组:Ⅰ组肾病极期,两个月内未经激素类药物治疗者(未治组)8例;Ⅱ组肾病极期,足量强的松治疗二周以上者(激素组)15例;Ⅲ组足量强的松治疗尿蛋白转阴2周以上者(阴转组)19例;Ⅳ组正常对照组(对照组)15例。iJu儿童肾病网

  2. PBMC上清液的制备:肝素抗凝静脉血,淋巴细胞分离液分出PBMC。调整细胞密度为1~2×106/ml。加入ConA 10 mg/L。孵育48小时,离心,收集上清。iJu儿童肾病网

  3.大鼠GEC体外培养:SD大鼠,体重100~ 150克,清洁取肾,顺序过筛法获取肾小球,培养于10%胎牛血清(FCS.K1)液中。待GEC以肾小球为中心铺展成片时,进行转种传代。第2代纯化GEC用于实验[4]。实验所用GEC形态观察为多角型,desmin免疫萤光为阴性,cytokeratin免疫萤光为阳性,嘌呤霉素氨基核苷毒性实验为阳性。符合文献[6,8]记载大鼠GEC特征。iJu儿童肾病网

  4. PBMC上清对GEC合成LN的影响:第2代GEC(细胞密度3~5×103/孔)中加入PBMC上清(0.1 ml/孔,终浓度50%),以10%FCS.K1液为阴性对照,24小时换液一次,收集48小时孵育液,竞争性放射免疫分析法测取LN含量。主要步骤:(1)竞争性结合:将待测样本、125 Ⅰ-LN及抗LN血清共同孵育,使样本中的LN竞争125Ⅰ-LN与一抗的结合;(2)分离:前述混合液中加入抗LN抗体的抗血清(二抗),充分孵育致LN-一抗-二抗复合物形成;(3)计数:γ计数仪测读复合物中125 Ⅰ计数。iJu儿童肾病网

  5. PBMC上清对GEC掺入3 H-prolin的影响:第二代GEC中加入PBMC,24小时后加入3H-prolin,1 μCi/孔,继续孵育24小时,收获GEC,液闪仪测读每孔3 H掺入值。iJu儿童肾病网

  6. PBMC上清对GEC合成Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响:同方法4。iJu儿童肾病网

  7.统计:(掺入)抑制指数=样本管min-1值/阴性对照管min-1值。Excel程序,t检验法计算各组间(抑制)掺入指数差异及其显著性。P<0.05为具显著性差异。iJu儿童肾病网

  结  果iJu儿童肾病网

  一、肾病患儿PBMC上清对GEC合成LN的影响 未治组患儿PBMC上清作用后GEC抑制指数(0.953 9±0.016 5)明显低于激素组(1.018 7±0.055 7)、阴转组(1.008 8±0.059 2)及正常组(1.036 9±0.030 3)、(P值均<0.05);后三组指数间无显著差异(P>0.05)。因为LN测定方法为竞争抑制法,此处未治组的低指数表示其合成能力高于其它各组。iJu儿童肾病网

  二、肾病患儿PBMC上清对GEC合成总胶原及Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响。iJu儿童肾病网

  1.对GEC合成总胶原(掺入3 H-prolin)的影响:见附图。结果显示未治组PBMC作用后的GEC掺入指数明显低于激素组、阴转组及正常组(P<0.05,分别为0.04、0.04和0.03)后三组间合成指数无显著性差异(P>0.05)。iJu儿童肾病网

  2.对GEC合成Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原的影响:PBMC作用后GEC合成Ⅲ前胶原未治组的抑制指数(0.969 1±0.009 1)明显低于激素组(1.000 8±0.053 6)、阴转组(0.992 7±0.036 9)及正常组(1.008 6±0.024 9)(P<0.05),后三组指数间无显著差异。Ⅳ型胶原抑制指数4组间无显著性差异,分别为1.037 0±0.013 5、1.045 9±0.051 1、1.043 9±0.050 9和1.076 7±0.060 1(P>0.05)。 iJu儿童肾病网

  一、INS患儿免疫细胞对GEC的直接作用 肾小球上皮细胞经由两个机制维持了肾小球滤过膜的通透功能:(1)GEC胞浆中丰富的细胞骨架蛋白的收缩作用稳定了GEC足突“指状突起”的结构,保证了肾小球的滤过面积和足突裂隙横膈“细滤器”的数量[6];(2)GEC可以合成胶原、糖蛋白、蛋白多糖等细胞外基质。基底膜的细胞外基质为细胞的固着提供了基础框架,并可作为盐类和小分子物质的滤过膜[6,8]。其中Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的“同种多聚体网络”是基底膜组成的二个重要系统,是“分子屏障”的物质基础。蛋白多糖物质的生物作用一则是作为此“同种多聚体”自身及两个多聚体间的连接成份,二则是提供了GEC表面的阴电荷,形成“离子屏障”。当GEC合成基质功能受损时,滤过膜的“分子屏障”和“离子屏障”作用均减弱,并可能导致GEC从基底膜脱落,进而诱发蛋白尿及刺激肾小球硬化的形成[8~11]。肾小球上皮细胞的功能受到炎性细胞及其因子、肾小球内其它细胞及细胞外基质的影响,而机体免疫细胞对GEC的影响在原发性肾病的发生中具有重要的意义。本系列的前期研究已揭示:肾病患儿免疫细胞产物可影响GEC合成多阴离子物质的功能[8]。我们在本研究中进一步观察到,肾病患儿免疫活性细胞(由ConA激活)能改变GEC合成LN、总胶原和胶原种类的活性。研究结果从细胞水平证实,原发性肾病的免疫细胞影响了肾小球细胞合成基质的功能。iJu儿童肾病网

  二、免疫细胞活性与激素治疗的关系 我们所见PBMC对GEC合成细胞外基质的活性作用表现在Ⅰ组(肾病未治组),Ⅰ组与Ⅱ组患儿的尿蛋白程度,各项血清生化指标均无明显差异,区别仅在于有无使用足量激素。Ⅱ组与Ⅲ组患儿PBMC对GEC合成的活性作用无显著差异,二组间治疗因素不变,而肾脏病症状却明显不同(Ⅲ组患儿肾病症状缓解)。这表明肾病患儿PBMC对GEC的作用与尿蛋白、血清生化指标等肾病症状无关,而与激素使用与否有关,并且PBMC的活性改变先于肾病症状的缓解。这一发现提示,激素治疗可改变肾病患儿PBMC对GEC合成功能的活性作用,此一通过改变免疫细胞活性进而改善肾脏细胞功能的作用途径,可能在激素治疗肾病的机制中占先导和(或)重要的作用。iJu儿童肾病网

  三、肾病患儿免疫细胞对GEC功能影响的相关因素 我们发现肾病患儿PBMC对GEC合成基质的影响与肾病的临床类型无相关关系(数据未显示)。鉴于本研究中肾炎型肾病的诊断依据主要为尿中出现红细胞,因此上述结果提示肾病患儿PBMC活性与血尿出现与否无相关关系。红细胞在尿中出现表明肾小球滤过膜结构(主要为分子屏障)受损。由于肾小球基底膜与其它基底膜不同之处在于其发生过程中由GEC和内皮细胞二种细胞产生的基底膜物质“粘合”而成,肾小球滤过膜的通透功能涉及了GEC(如足突裂隙、阴电荷强度)和内皮细胞结构(如内皮细胞窗等)两种细胞的变化。我们的结果否定了肾病患儿PBMC作用后GEC合成基质的变化与肾病血尿的相关关系,提示在此类原发性肾病的血尿形成中,可能内皮细胞生物功能及(或)细胞微结构的变化起了更主要的作用。iJu儿童肾病网

  我们所观察肾病患儿的组织改变均有“足突融合”,但其PBMC对GEC的活性作用却明显不同。由于足突形成的机理涉及了GEC表面阴电荷及胞浆中的收缩蛋白,PBMC对GEC的作用与上述病理变化无相关关系,这就提示,此类肾病中GEC合成基质功能的变化可能不是造成足突融合的主要机制。iJu儿童肾病网

  肾病的发生是多种因素作用的结果,肾病临床症状的改善与肾脏的组织变化亦不同步[12],其中除了循环免疫细胞对肾小球细胞的直接作用外,肾小球固有细胞的相互作用及免疫细胞对此相互作用的影响等因素还有待进一步的研究。iJu儿童肾病网

  总后勤“九五”规划医药卫生科研基金资助课题iJu儿童肾病网

  参 考 文 献iJu儿童肾病网

  1 Koyama A, Fujisaki M, Koboyashi M, et al. A glomerular permeability factor produced by human T cell hybridomas. Kidney Int, 1991.40∶453.iJu儿童肾病网

  2 Tomizawa S, Suzuki S, Oguri M, et al. Studies of T lymphocyte function and inhibitory factors in minimal change nephrotic syndrome. Nephron, 1979,24∶179.iJu儿童肾病网

  3 Cybulsky AV, Carbonetto S, Huang QL, et al. Adhesion of rat glomerular epithelial cells to extracllular matrices: role of β 1 integrins. Kidney Int, 1992,42∶1099.iJu儿童肾病网

  4 王宝琳,扬霁云,张伯科.IL-1对大鼠肾小球上皮细胞增殖和合成含硫酸根物质的影响.上海免疫学杂志,1993,13∶18.iJu儿童肾病网

  5 Harper PA, Robinson JM Hoover RL, et al. Improved method for culturing rat glomerular cells. Kidney Int, 1984,26∶875.iJu儿童肾病网

  6 Kriz W, Elger M, Nagata M, et al. The role of podocytes in the development of glomerular sclerosis. Kidney Int, 1994,45∶S64.iJu儿童肾病网

  7 Couchman RJ, Benavan AL, McCarthy JK. Glomerular matrix: synthesis, turnover and role in mesangial expansion. Kidney Int, 1994,45∶328.iJu儿童肾病网

  8 王丹,扬霁云,王宝琳.肾病患儿外周血单个核细胞产物对大鼠肾小球上皮细胞的影响.儿科杂志,1994,32∶83.iJu儿童肾病网

  9 Dantal J, Bigot E, Bogers W, et al. Effect of plasma protein absoption on protein excretion in kidney transplant recipients with recurrent nephrotic syndrom. N Engl J Med, 1994,330∶7.iJu儿童肾病网

  10 Ruoslanhti E. and Reed JC. Anchorage dependence, integrins, and apoptosis. Cell, 1994, 77∶477.iJu儿童肾病网

  11 Ichikawa I, and Fogo A. Focal segmental glomerulosclerosis. Pedia Nephrol, 1996,10∶374.iJu儿童肾病网

  12马恒颢,谢祥鳌,庄昭勤,等.缓解与反复的肾病综合征患儿的病理动态对照分析(29例小儿重复肾活检报告).肾脏病杂志,1994,10∶145.iJu儿童肾病网


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